談補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠PTEN mRNA 的影響論文

　　缺血性腦疾病主要是由于腦血供障礙，腦細(xì)胞功能喪失而引起的一系列神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙性疾病。在腦中風(fēng)事件中，有80% 由腦缺血造成中風(fēng)后神經(jīng)功能缺失及死亡; 在我國，心腦血管病發(fā)病率居世界第二，其患病率、死亡率、致殘率居高難下，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量和生活水平。補(bǔ)陽還五湯是目前治療腦卒中等血栓性疾病應(yīng)用頻率最高的方劑，廣泛應(yīng)用于防治缺血性腦血管病、冠心病、心肌梗死及其他血栓栓塞性疾病。補(bǔ)陽還五湯治療缺血性腦疾病療效確切，但其分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究; 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯具有抗血小板的作用，同時(shí)，最新指南推薦在缺血性腦卒中的防治中應(yīng)用抗血小板藥物，而第10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因( PTEN)與P-選擇素( CD62P) 與血小板活化密切相關(guān)。因此，本文使用補(bǔ)陽還五湯預(yù)處理2 周后的SD 大鼠復(fù)制局灶性腦缺血再灌注模型，測定血漿中血小板活化標(biāo)記物CD62P 含量及海馬組織中PTENmRNA 表達(dá)情況，探討補(bǔ)陽還五湯對抗腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制與血小板活化的關(guān)系。

　　1 材料

　　1. 1 動(dòng)物

　　SPF 級SD 雄性大鼠60 只，體重250 ～300 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號SCXK( 粵) 2013-0002。

　　1. 2 藥物與制劑

　　硫酸氫氯吡格雷片( 賽諾菲制藥有限公司，批號2A782) ，補(bǔ)陽還五湯顆粒劑水溶液按照《醫(yī)林改錯(cuò)》所載的藥味用量進(jìn)行制備。處方為: 生黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍4. 5 g，地龍、桃仁、紅花、川芎各3 g，( 黃芪顆粒劑，批號311001T;當(dāng)歸顆粒劑，批號1307117; 赤芍顆粒劑，批號309081T; 地龍顆粒劑，批號1308206; 川芎顆粒劑，批號1308137; 桃仁顆粒劑，批號309127T; 紅花顆粒劑，批號1307190) ，取相當(dāng)于飲片等量的各味藥顆粒劑( 由廣東一方制藥有限公司提供) 混合后，用100 ℃蒸餾水配制成補(bǔ)陽還五湯水溶液備用。

　　1. 3 儀器與試劑

　　ABI 7500 型熒光定量PCR 儀( 美國ABI 公司) ，Hema9600 型基因擴(kuò)增儀( 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司) ，1524R 型低溫冷凍離心機(jī)( 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司) ， JS-power300 型電泳儀與培清JS-780 型全自動(dòng)凝膠成像分析儀( 上海培清科技有限公司) ，K2800 型紫外核酸分析儀( 北京凱奧科技有限公司) 。CD62P 試劑盒( 華美生物公司，批號CSB-E07399r) ，SYBR K Premix Ex TaqTM( 日本TAKARA 公司，批號DRR420A) ，ReverseTranscriptase M-MLV 試劑盒( 日本TAKARA 公司，批號D2639A) ，Trizol ( 美國Invitrogen 公司，批號10296-010) ，CTAB( 美國BBI，批號CB0108) ，DEPC( 美國Sigma 公司，批號472565 ) ，瓊脂糖( Hydragene，批號R9012TAB) ，其余所需試劑由廣州化學(xué)制劑總廠提供。

　　2 方法

　　2. 1 動(dòng)物分組使用隨機(jī)數(shù)字表法將60 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分成5 組，每組12 只。即假手術(shù)組( 生理鹽水ig) 、模型組( 生理鹽水ig) 、氫氯吡格雷組( 6. 8 mg·kg - 1·d - 1 ) ，補(bǔ)陽還五湯高、低劑量組( 26，6. 5 g·kg - 1·d - 1 ) ，以上各組所用劑量均參照課題組前期實(shí)驗(yàn); 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，再按照相應(yīng)的藥物ig 給藥，每天2 次，連續(xù)2 周。

　　2. 2 局灶性腦缺血再灌注模型制作大鼠造模參照文獻(xiàn)的方法，采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法( MCAO) 復(fù)制局灶性腦缺血模型，并在造模前2 h給予相應(yīng)藥物ig。大鼠10%水合氯醛( 1. 0 g·kg - 1 )ip 麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)操作臺上，消毒后其余步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行。假性手術(shù)組僅作皮膚切開和血管剝離，不做栓線處理，其余操作同其他組。造模完成后60 min 拔除栓線，待動(dòng)物清醒后2 h 進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

　　2. 3 觀察指標(biāo)

　　2. 3. 1 神經(jīng)行為評分動(dòng)物于清醒后2 h 參照文獻(xiàn)進(jìn)行神經(jīng)行為評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下: 0 分無神經(jīng)損傷癥狀; 1 分不能完全伸展對側(cè)前爪; 2 分向?qū)��?cè)轉(zhuǎn)圈; 3 分向?qū)��?cè)傾倒; 4 分不能自發(fā)行走，意識喪失。

　　2. 3. 2 檢測血漿CD62P 含量拔除栓線再灌注12 h后大鼠經(jīng)10%水合氯醛ip 麻醉( 1. 0 g·kg - 1 ) ，眼眶取血約2 mL 置于真空肝素鈉抗凝管中，4℃，3 000 r·min - 1，離心30 min，吸取血漿，放置于- 20 ℃冰箱，備測。采用酶聯(lián)免疫定量檢測技術(shù)檢測大鼠血漿CD62P 的含量; 操作過程均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

　　2. 3. 3 測定海馬組織PTEN mRNA 表達(dá)拔除栓線再灌注12 h 后大鼠經(jīng)10% 水合氯醛ip 麻醉( 1. 0g·kg - 1 ) ，生理鹽水灌洗，4%多聚甲醛固定后迅速取腦組織，分離海馬，用RNA later 溶液預(yù)處理海馬組織。Trizol 法進(jìn)行總RNA 提取海馬組織總RNA，并進(jìn)行純度分析。引物設(shè)計(jì)與合成由廣州貝奧吉因生物科技有限公司完成，PTEN 與內(nèi)參基因引物序列詳見表1。RNA 反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行;反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)Real-Time PCR 的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算出反應(yīng)體系中待測樣本cDNA 達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)( cycle count，Ct) 。實(shí)驗(yàn)中各個(gè)樣本均做2 個(gè)復(fù)孔。以假手術(shù)組做對照，使用2 - ΔΔCt值計(jì)算mRNA 相對表達(dá)情況。2. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果均以珋x ± s 表示，等級資料比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)采用LSD-t 檢驗(yàn)或者Nemenyi檢驗(yàn)( 非參數(shù)檢驗(yàn)兩兩比較) ，以P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　3 結(jié)果

　　3. 1 對神經(jīng)行為評分的影響與假手術(shù)組比較，模型組的神經(jīng)行為評分顯著升高; 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯與氫氯吡格雷均能明顯降低大鼠神經(jīng)行為評分( P < 0. 01)。

　　3. 2 對血漿CD62P 含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組血漿中CD62P 表達(dá)顯著升高( P < 0. 05) ; 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯高劑量組與氫氯吡格雷組均能顯著抑制血漿中CD62P 表達(dá)( P < 0. 05)。

　　3. 3 對海馬組織中PTEN mRNA 表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織中PTEN mRNA 表達(dá)顯著升高( P < 0. 05) ; 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯與氫氯吡格雷均能下調(diào)海馬組織PTEN mRNA 的病理性過表達(dá)( P < 0. 05)。

　　4 討論

　　腦血管疾病為臨床常見病，由于其病死率高，國內(nèi)外在臨床治療上仍主要推薦以阿司匹林預(yù)防為主，但10 年前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)阿司匹林與氫氯匹格雷在腦缺血疾病防治中出現(xiàn)了無應(yīng)答狀況，因此，尋找類似抗血小板藥物迫在眉睫。近年研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯具有抗血小板活化、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎等作用，在臨床抗腦缺血治療中應(yīng)用廣泛; 尹天雷通過原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯能上調(diào)磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B( PI3K/AKT) 陽性細(xì)胞表達(dá)，其抗腦缺血作用與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。PTEN 基因是具有蛋白酯酶與磷酸酶雙重生物活性的抑癌基因，能夠使PI3K 產(chǎn)生的第二信使去磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路，干預(yù)細(xì)胞凋亡過程進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。本文研究亦發(fā)現(xiàn)在缺血預(yù)處理中，補(bǔ)陽還五湯神經(jīng)保護(hù)作用與下調(diào)PTEN 基因有關(guān)。另外，Weng Z 等研究發(fā)現(xiàn)PTEN 基因缺失會導(dǎo)致血小板數(shù)目增多、出血時(shí)間縮短，患者易于栓塞，即PTEN 基因參與了血小板激活過程; 不僅如此，PTEN 基因還可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥通路進(jìn)而減輕腦組織炎癥反應(yīng)。

　　此外，CD62P 亦可通過與白細(xì)胞相互作用參與炎癥反應(yīng)等過程。因此，本文選用血小板活化標(biāo)記物CD62P 檢測血小板活化情況，并在神經(jīng)功能評分基礎(chǔ)上檢測了PTEN mRNA 表達(dá)情況，探討補(bǔ)陽還五湯對抗腦缺血再灌注損傷與血小板活化的內(nèi)在關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯預(yù)處理能抑制血小板活化并顯著降低模型大鼠的神經(jīng)功能評分，其作用效果與氯匹格雷相似，提示補(bǔ)陽還五湯預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其抑制血小板活化有關(guān); 另外還發(fā)現(xiàn)腦缺血后血小板大量激活，PTEN 基因過度表達(dá)，易于出現(xiàn)腦梗后再出血并發(fā)癥，而補(bǔ)陽還五湯能通過下調(diào)過表達(dá)的PTEN 基因而干預(yù)PI3K/AKT 信號通路，進(jìn)而在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與血小板活化的同時(shí)，減輕炎性反應(yīng)造成的組織損傷，表明補(bǔ)陽還五湯神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能與下調(diào)PTEN 基因過表達(dá)及抑制CD62P表達(dá)有關(guān)，而其主要機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，未來筆者將進(jìn)一步研究補(bǔ)陽還五湯對PI3K/AKT 信號通路的其他靶點(diǎn)基因的影響。

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