談PTEN對苦參堿抑制LoVo細(xì)胞的影響論文

　　苦參堿是中藥苦參中的主要生物堿類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗膽管瘢痕等多種生物活性。人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologd on chromosome 10，PTEN)是Li等在1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因�？鄥�堿可通過滅活A(yù)kt通路抑制人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞系增殖和誘導(dǎo)凋亡。本研究采用小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)技術(shù)沉默PTEN 基因，探討PTEN 在苦參堿抑制LoVo細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)凋亡中的作用，報道如下。

　　1 材料與方法

　　1.1 一般材料

　　結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室惠贈。苦參堿(98%)(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭科技有限公司)，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，PTEN 抗體，Bax、Bcl-2抗體(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)，p-Akt抗體(江蘇睿灜生物技術(shù)有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

　　LoVo細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液(含青霉素100u/mL和鏈霉素100mg/L)，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　1.2.2 siRNA序列的合成及轉(zhuǎn)染

　　在PTEN-siRNA3條序列中選取其中沉默效率最高的1條序列，序列為5’-CCAGUCAGAGGCGCUAUGUTT-3’;陰性對照組siRNA(NC-siRNA)序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。按吉瑪轉(zhuǎn)染說明書將PTENsiRNA與lipofectamine>TM2000混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與OPTI-MEM 培養(yǎng)液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h后更換為含血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

　　1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

　　將LoVo細(xì)胞分為空白對照組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染加藥組、陰性對照組、陰性轉(zhuǎn)染加藥組和加藥組。其中轉(zhuǎn)染組LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA，轉(zhuǎn)染加藥組轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA 并加入苦參堿1mg/mL，陰性對照組轉(zhuǎn)染NC-siRNA，陰性轉(zhuǎn)染加藥組轉(zhuǎn)染NC-siRNA并加入苦參堿1mg/mL，加藥組不轉(zhuǎn)染但加入苦參堿1mg/mL，空白對照組不轉(zhuǎn)染不加藥。

　　1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

　　空白對照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、2.50mg/mL苦參堿處理，培養(yǎng)24、48、72h后分別加入MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，加入150 μL 二甲基亞砜振蕩溶解，酶標(biāo)儀(SpectraMax M5)490nm波長下讀取吸光度(opticaldensity，OD)值。

　　1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測

　　將各組細(xì)胞分別以每孔2×105 密度接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿時用200μL槍頭在每孔中垂直劃一道直線，吸取培養(yǎng)液，PBS清洗2次，更換新鮮不含血清的培養(yǎng)基，并分別用苦參堿(0、1.0mg/mL)處理，分別于0、24、48h后拍照，比較各組細(xì)胞遷移距離。

　　1.2.6 細(xì)胞侵襲能力檢測

　　將Matrigel基質(zhì)膠用DMEM 完全培養(yǎng)基1∶8稀釋后均勻鋪在孔徑為8μmol/L的Transwell小室上表面，置于37℃培養(yǎng)箱中4h使之凝固。將已處理的各組細(xì)胞用胰酶消化后，分別用不含血清的培養(yǎng)基重懸，以2×105 個/孔密度接種于小室上室，下室加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后用棉簽擦掉小室上表面未穿越的細(xì)胞，甲醇固定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)取5個視野200倍光鏡下拍照。

　　1.2.7 Western blot檢測

　　分別將培養(yǎng)48h的各組細(xì)胞收集起來，采用RIPA 裂解液提取蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。蛋白上樣SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，置于PBST配置的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶中室溫封閉1h，加入一抗，于4℃孵育過夜，PBST洗滌后加入二抗(山羊抗兔IgG)，室溫孵育1h，PBST洗滌后用化學(xué)發(fā)光試劑處理后顯影。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

　　采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珚x±s)表示，采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 空白對照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞殘余活性比較

　　培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)染組不同苦參堿濃度作用下細(xì)胞殘余活性均高于空白對照組(P<0.05)。隨苦參堿濃度升高，2組細(xì)胞殘余活性均降低。 空白對照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞殘余活性比較 (珚x±s，%)。

　　2.2 各組細(xì)胞遷移距離比較

　　處理24、48h時，空白對照組細(xì)胞刮痕寬度長于轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染加藥組，短于陰性加藥組和加藥組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染加藥組、陰性轉(zhuǎn)染對照組、陰性轉(zhuǎn)染加藥組和加藥組細(xì)胞刮痕寬度長于轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，陰性對照組、陰性轉(zhuǎn)染加藥組和加藥組長于轉(zhuǎn)染加藥組，陰性轉(zhuǎn)染加藥組和加藥組長于陰性對照組(P<0.05)。陰性轉(zhuǎn)染加藥組細(xì)胞遷移距離與加藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。

　　2.3 各組細(xì)胞穿膜數(shù)量比較

　　與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染加藥組細(xì)胞穿膜數(shù)量均增加，陰性轉(zhuǎn)染加藥組和加藥組細(xì)胞穿膜數(shù)量均減少。

　　2.4 各組細(xì)胞PTEN、p-Akt、bax、bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

　　空白對照組PTEN、Akt、bax蛋白表達(dá)量低于加藥組和陰性轉(zhuǎn)染加藥組，高于轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染加藥組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染組PTEN、bax蛋白表達(dá)量明顯低于空白對照組、加藥組和陰性轉(zhuǎn)染加藥組，高于轉(zhuǎn)染加藥組(P<0.05)，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。轉(zhuǎn)染組bc達(dá)明顯高于空白對照組、陰性對照組、加藥組和陰性轉(zhuǎn)染加藥組，低于轉(zhuǎn)染加藥組(P<0.05)�？瞻讓φ战Mpten、akt、bax、bcl-2蛋白表達(dá)量與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)�？瞻讓φ战Mp-Akt蛋白表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染加藥組(P<0.05)，高于陰性轉(zhuǎn)染加藥組和加藥組(P<0.05)，與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。

　　3 討 論

　　目前關(guān)于苦參堿抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制的研究較多，研究結(jié)果表明苦參堿通過抑制JAK2/STAT3 信號通路誘導(dǎo)膽管癌KMCH-1和MzChA-1細(xì)胞凋亡�？鄥�堿可通過引發(fā)線粒體途徑抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-Rb50細(xì)胞生長及誘導(dǎo)凋亡。但關(guān)于PTEN在苦參堿抑制腫瘤細(xì)胞生長促進(jìn)凋亡中的作用的研究較少。本研究應(yīng)用siRNA技術(shù)對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞PTEN 基因進(jìn)行研究，比較沉默PTEN前后及聯(lián)合苦參堿處理后LoVo細(xì)胞的生長情況，結(jié)果表明在沉默PTEN 基因后，苦參堿抑制LoVo細(xì)胞的增殖作用明顯減弱，遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，未經(jīng)PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染單純使用苦參堿處理的LoVo 細(xì)胞遷移和侵襲能力均減弱。

　　Western blot結(jié)果顯示加藥組PTEN表達(dá)明顯高于空白對照組，轉(zhuǎn)染加藥組PTEN 水平高于轉(zhuǎn)染組，提示苦參堿可上調(diào)PTEN 表達(dá)水平，當(dāng)沉默PTEN 時，p-Akt表達(dá)水平明顯上調(diào)，說明PI3K-Akt信號通路被激活并抑制細(xì)胞凋亡。PTEN作為PI3K-Akt信號通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，可抑制PI3K-Akt信號通路激活并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)PTEN 基因被沉默、突變、滅活時可激活PI3K 的效應(yīng)器，尤其是激活A(yù)kt，進(jìn)而引起腫瘤發(fā)生。研究結(jié)果表明，人類惡性腫瘤中Akt活性明顯增強(qiáng)，Akt的活化對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。

　　Bcl-2是重要抗凋亡基因，bax是重要促凋亡基因，Bcl-2可與促凋亡基因Bax形成二聚體，如Bax相對量高于Bcl-2，則Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡;如Bcl-2相對量高于Bax，則促進(jìn)形成Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl-2同二聚體的量增多，從而抑制細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示，加藥組中bax表達(dá)高于空白對照組，bcl-2表達(dá)低于空白對照組，提示苦參堿可誘導(dǎo)bcl-2表達(dá)水平下調(diào)、誘導(dǎo)bax表達(dá)水平上調(diào)，PTEN基因沉默時，苦參堿對2種蛋白的表達(dá)水平呈相反作用，抑癌基因PTEN在苦參堿抑制LoVo細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)凋亡中起關(guān)鍵作用，苦參堿抑制LoVo細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是通過PTEN-Akt信號通路。本研究結(jié)果提示，PTEN可能成為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)，為苦參堿研發(fā)成抗腫瘤新藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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