低溫誘導植物染色體加倍實驗的探究與改進分析論文
隨著中學生物實施課程改革，從2009年按開始，內(nèi)蒙古自治區(qū)高中生物教材從以前選用人教版全日制普通高中生物教材改為選用人教版新課程標準實驗教科用書�！陡咧猩镎n程標準》。尊重學生多樣化發(fā)展的新需求，更貼近實際和生活經(jīng)驗，更重視發(fā)展學生的實踐能力�！缎抡n標》中明確指出要倡導探究性學習，要讓學生勤于動手。
與過去的教材相比《新課標》中生物實驗的比重明顯增加，有些實驗是以前教材不要求的，低溫誘導染色體加倍實驗便是其中之一。實驗教學屬于必需親自操作后才能有深刻體會的教學內(nèi)容，有的實驗如果單單照搬教科書上的過程，在實際操作中會遇到許多問題，會對教學效果產(chǎn)生不利影響。因此，對于《新課標》中涉及的實驗內(nèi)容，實驗教師要提前感受為好。 面對中學生物《新課標》實施的現(xiàn)實，大學實驗課程教學中要有適當?shù)捏w現(xiàn)，要使生物教育專業(yè)的本科畢業(yè)生所獲得的實踐技能能夠貼近《新課標》的要求。目前，我校生物教育專業(yè)的本科實驗教學內(nèi)容中還沒有低溫誘導染色體加倍實驗的項目，為了促進教學改革，為今后實驗項目設(shè)計提供幫助，特開展了本實驗的研究，以期找到能體現(xiàn)最佳實驗效果的方法。
1材料與方法
1. 1實驗材料
實驗中分別選擇了洋蔥、大蒜做為實驗材料。大蒜生根前放入4℃冰箱以打破體眠期，提高出根率。試驗時選取健壯的大蒜瓣，剝?nèi)ニ馄�，�?0枚，每5枚大蒜為一組用細木棍穿起來放入盛有清水的容器中進行室溫培養(yǎng)。水以浸沒根部為宜，每兩天換一次水，根尖3d長到約lcm長，此時將裝置轉(zhuǎn)入4℃的冰箱里進行低溫誘導。洋蔥的培養(yǎng)方法為選取健壯洋蔥放入盛有清水容器中，水以沒過洋蔥根部為宜，每兩天換一次水，室溫培養(yǎng)。
1.2材料處理與方法
1.2. 1實驗材料的固定
固定是借助于物理方法或化學藥物的作用，迅速滲入組織和細胞將之殺死，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物盡可能地保持生活時的真實狀態(tài)，本實驗用的固定液是卡諾氏液(無水酒精:冰醋酸=3:1)。根據(jù)《高中人教版生物必修二》中低溫誘導染色體數(shù)目化的實驗 (以下簡稱教材)進行實驗操作，低溫鄉(xiāng)導完成后，取約lcm長的根尖(教材上要求取5cm，但根尖應取得稍微長一點，便于從溶液中取，可以在染色時再截至適宜長度)，將其放入卡諾二液中浸泡，教材上要求浸泡0. 5-1h，但在實驗中發(fā)現(xiàn)用卡諾氏液浸泡根尖0. 5h為最佳，因為洋蔥根尖比較細，卡諾氏液本身有殺死細胞的作用，如果固定的時間過長，根尖容易發(fā)黃萎蔫，不利于對材料進行觀察;另外，固定根尖0. 5h時根尖細胞的分散程度以及固定程度比較好。
1.2.2解離
解離是為了除去細胞間的果膠以使細胞壁軟化，從而使細胞在壓片時更易分散;此外還可使細胞相互分離開，防止重疊現(xiàn)象的發(fā)生，便于觀察細胞中的染色體數(shù)目變化。所以，適當延長解離時間可以讓細胞的分開程度加大。在本實驗的改進中關(guān)鍵是對解離時間的把握。教材上要求用解離液在室溫下解離3-5 min，實驗發(fā)現(xiàn)對根尖解離10min最佳。根尖剛開始解離2min，根尖部位開始發(fā)白膨大，5 min后進行染色制片發(fā)現(xiàn)根尖不易被搗碎，不能被敲散成霧狀，更不易被充分染色，細胞重疊度較大。解離10min后根尖解離達到最佳狀態(tài)，染色的時候可以被搗碎，從而充分染色，并且在制片的時候，蓋玻片蓋下的同時根尖就分散開來，且保持根尖形狀不變，更容易找到分生區(qū)細胞。
1.2.3漂洗
教材中提到用清水漂洗，但是本實驗的漂洗最好用蒸餾水，除了洗去解離液防止解離過度外，也可起到低滲作用，使細胞體積有一定的膨脹，便于以后染色體形態(tài)的觀察.根尖材料要漂洗三遍，每遍2-3 min，注意動作要輕，不要弄壞了根尖形態(tài)。
1.2.4染色
教材上采用龍膽紫染色或醋酸洋紅染色，但是實驗發(fā)現(xiàn)，用醋酸洋紅染液進行制片染色效果更佳，龍膽紫染色不清晰。而醋酸洋紅染液是一種細胞核染液，可以使染色體部分染色較深，而細胞質(zhì)部分基本不染色，染出的裝片細胞核明顯，便于觀察。在取材方面，教材上是把根尖浸泡入玻璃皿中染色3-5 min，這樣操作材料染色過深，反而不利于實驗的觀察，另外根尖經(jīng)過解離己經(jīng)變得酥軟，如果此時放入染液不容易把根尖完整地取出。為了避免染色過深和對根尖材料的損傷，實驗參照林荔等的研究結(jié)果進行了改動。在載玻片中央滴一滴清水，用鑷子夾起解離、漂洗后的根尖材料放于清水里，用刀片把根尖材料切到合適長度，約5mm，再滴加一滴醋酸洋紅染液，用鑷子將根尖輕輕搗碎細胞完全分散。這樣，不僅核內(nèi)染色體易被染色，且縮短了染色時間，染色3 min，接著再進行制片。
1.2.5制片
在蓋玻片上鋪吸水紙，以手按壓，注意力度，防止蓋玻片滑動，再以吸水紙在蓋玻片四周把水和染液吸干，吸干水后用鑷子鈍頭輕輕敲打蓋玻片下的材料，使材料霧狀均勻分散，便于觀察。教材中以蓋玻片上加蓋載玻片的方法按壓，玻片易滑動，不容易操作。制片結(jié)束后，用高倍鏡觀察細胞染色體情況。
2實驗結(jié)果
2. 1洋蔥和大蒜實驗效果比較
文獻資料顯示，在低溫誘導染色體加倍實驗這一實驗中，與大蒜相比，洋蔥根尖細胞分裂相旺盛期持續(xù)時間短且不明顯。根據(jù)實驗結(jié)果來看，實驗制片觀察洋蔥與大蒜染色體效果差別不是很明顯。
2. 2大蒜根尖在低溫條件下不同處理時間的實驗結(jié)果
實驗在4℃低溫下分別對大蒜進行36h,48h,72h的染色體變異誘導，然后再室溫培養(yǎng)24h，隨后鏡檢實驗效果。結(jié)果顯示:經(jīng)過鏡檢三種處理均沒有發(fā)現(xiàn)染色體加倍的細胞。雖然如此，發(fā)現(xiàn)低溫誘導72h處理后，根尖細胞處于分裂期的細胞多。
3討論與分析
從染色效果看，洋蔥與大蒜染色體效果差別不大，表明二者均是觀察染色體染色的良好材料。通過比較大蒜和洋蔥的根尖細胞發(fā)現(xiàn)，由于洋蔥根尖細胞分裂相旺盛期持續(xù)時間短，使用大蒜觀察效果較好。由于低溫誘導染色體變異機制是抑制了紡錘體的作用，因此，細胞分裂約旺盛實驗越容易成功。因此，總體來說，大蒜對于低溫誘導染色體變異實驗項目來說是更可取的。
對于誘導染色體變異來說，常用秋水仙素和低溫誘導。但是，由于秋水仙素有劇毒，不易用于中學生物實驗，故此本次實驗探究用低溫誘導染色體變異的最佳條件。低溫處理雖然效果欠佳，但具有易操作、安全、成本低等誘導。
本次實驗雖然設(shè)置了不同時間的低溫處理，但結(jié)果并未觀察到染色體加倍現(xiàn)象。這一則可能與低溫誘導效率低，且由于實驗時間緊未能反復進行大量實驗有關(guān);另一方面也可能與處理溫度不適合有關(guān)，張興蓮等研究認為誘導染色體變異的溫度在2℃到4℃范圍內(nèi)更佳。但是，實驗室目前冰箱不具有2 -4℃的調(diào)溫功能。此外，多倍體難以觀察也是實驗不易成功的原因之一，觀察染色體的最佳時期是分裂中期，而低溫誘導染色體加倍的'機制是抑制紡錘體的作用而阻礙細胞有絲分裂一分為二，發(fā)生染色體加倍的細胞必須是染色體己復制的細胞，只有當該細胞進入到下一個分裂周期的中期或后期時才能確保觀察到結(jié)果，而低溫降低酶的活性，細胞分裂速度受限，結(jié)果不易觀察。
從誘導時間上來看，雖然本次實驗未能觀察到染色體加倍現(xiàn)象，但誘導72h的處理細胞分裂旺盛。由于低溫誘導的染色體加倍發(fā)生在細胞分裂期，分裂旺盛暗示72h處理與36h和48h相比是更合適的處理。
4結(jié)論
本課題就高中生物學新課程&“低溫誘導植物染色體數(shù)目的變化&”實驗提出了一些細節(jié)上的補充，并通過在培養(yǎng)、取材、固定、解離、染色、漂洗等常規(guī)實驗步驟做了更詳細的處理，以提高實驗的成功率，提高實驗結(jié)果觀察的可行性和可靠性，來保證實驗教學的順利進行。在低溫誘導方面采取了2 - 4 0C的低溫，低溫誘導時間為72h時實驗效果最佳。本課題值得探討的地方還有很多，應該進行對誘導最適溫度和時間的精確測量，以增加誘導植物染色體加倍的成功率。
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